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【技術在線】HCP ELISA方法驗證——加標回收（Spike & Recovery）

前言

在ELISA試劑盒的使用過程中，確保結果的準確性至關重要。為了有效識別樣品配方與試劑盒組分之間的兼容性，加標回收這一關鍵驗證試驗顯得尤為重要。它不僅是評估ELISA試劑盒準確性的重要工具，也是滿足法規和藥典（如ICH或FDA指南等）對商品化ELISA試劑盒方法學驗證要求的可靠方式。

什么是加標回收？

加標回收就是將已知量的標準品添加到樣品中（“加標”，spiking），通過對比加入前后的檢測結果，評估“回收”（recovery）測量值的準確性。這一過程可以揭示樣品及其緩沖液中某些成分是否會干擾檢測結果。目前，影響ELISA試劑盒定量結果的常見因素包括極端pH、去污劑、有機溶劑、高蛋白質濃度以及高鹽濃度等。因此，在進行加標回收實驗之前，確保排除這些干擾因素是至關重要的。

如何判定干擾因素？

樣品或緩沖液中的某些成分可能會影響HCP或其他雜質的檢測與定量，導致回收結果的高估或低估，由此說明樣品中存在干擾因素。同樣，上游收獲物和過程樣品的基質中也可能存在疑似干擾 ELISA 檢測的成分。

在有干擾的情況下，實驗結果通常表現為回收率偏低。但是，如果藥物本身或其他基質組分與捕獲或檢測抗體有相互作用，則可能表現為回收率偏高。

此外，非特異性干擾，如試劑與孔板的結合，也會導致OD值偏高。通過合理控制實驗流程，可以找出具體的干擾因素。

何時進行加標回收實驗？

在進行加標回收實驗前，需要先完成樣品的稀釋線性分析，只有明確了最低需求稀釋倍數（MRD），加標回收分析才有意義。（稀釋線性分析的詳細內容請參考《HCP ELISA方法驗證——稀釋線性dilution linearity》）

（Tips：每種類型的樣品基質都需要進行加標回收分析。同時如果實驗步驟進行了優化，則需要重復此實驗以確保檢測的有效性。）

如何執行加標回收分析？

樣品制備：

加標樣品：可以設定3-4個不同濃度的標準品加入到不同類型待檢樣品中，制備成加標樣品，需要注意的是加標樣品的濃度需在滿足MRD的條件下進行分析，也就是最低加標濃度不能低于LOQ的兩倍。
對照樣品：按相同體積比在每種待檢樣品中加入樣品稀釋液，制備成對照樣品，用于測定樣品本底的HCP濃度。

實驗過程：

使用ELISA試劑盒同時檢測加標樣品和對照樣品，每個樣品最好做3個重復孔，以計算均值。

結果分析：

回收率計算公式：

如下表案例所示，我們使用大腸桿菌HCP ELISA試劑盒（F410）分別檢測加標樣品（100 ng/mL標準品與樣品按1:4體積比混合，加標濃度為20 ng/mL）和對照樣品（樣品稀釋液與樣品按1:4體積比混合），通過測得的HCP濃度計算出回收率為95%。

依據ICH、FDA及EMA等分析方法驗證指南要求，HCP加標回收率的可接受范圍應在75%~125%。

為了方便您快速了解如何用4倍稀釋法制備加標樣品和ELISA布板的詳細步驟，請觀看以下操作視頻。

加標回收問題排查

如果加標回收數據顯示出明顯的產物或基質干擾，您可能需要通過進一步稀釋樣品或置換緩沖液等方式來獲取準確的檢測結果。理想情況下，請選擇與標準品相同的稀釋液進行樣品稀釋，這樣可以最大限度地減少偏差。在某些情況下，調整檢測方法也許能提高特定樣品類型的準確性，但請務必謹慎操作，以免影響結果的可靠性。

為了全力支持客戶進行加標回收驗證及方法學開發，Cygnus為每款ELISA試劑盒都配備了相應的標準品，詳情請查閱下表。

貨號	品名	規格	適用的試劑盒貨號
F553H-1	CHO HCP Antigen Concentrate, 3G	400 μl	F550-1
F1048X	CHO Lysate HCP Antigen Concentrate	200 uL	F1045
F1023X	E. coli HCP 2G Antigen Concentrate	200 uL	F1020
F1063X	BL21(DE3) HCP Antigen Concentrate	200 μl	F1060
F653SX	HEK 293 Antigen Concentrate	250 μl	F650S
F1043X	Sf9 HCP 3G Antigen Concentrate	200 μl	F1040
F1018X	P. pastoris HCP Antigen Concentrate	200 μl	F1015
F143U	P. pastoris Antigen Concentrate	200 μl	F140/F640
F978X	Vero Cell 2G HCP Antigen Concentrate	400 μl	F975
F1058X	PER.C6 HCP 2G Antigen Concentrate	200 μl	F1055
F1033X	SP2/0 HCP 2G Antigen Concentrate	200 uL	F1030
F998X	PG13 HCP Antigen Concentrate	200 uL	F995
F493G	L. lactis HCP Antigen Concentrate	200 μl	F490
F233G	A549 Antigen Concentrate	200 μl	F230
F813X	HeLa Antigen Concentrate	1 ml	F810
F803X	MDCK Antigen Concentrate	1 ml	F800
F513G	BHK HCP Antigen Concentrate	1 ml	F510
F227C	NS/0 Antigen Concentrate	1 ml	F220
F453X	P. fluorescens Antigen Concentrate	1 ml	F450
F823X	CAP® Antigen Concentrate	400 μl	F820
F1028X	C1 HCP Antigen Concentrate	200 uL	F1025
F603X	Protein A Antigen Concentrate	250 μl	F600
F613X	Protein A Antigen Concentrate	250 μl	F610
F403H	Protein A Antigen Concentrate	200 μl	F400
F044	Protein A Concentrate	200 μl	F050/F050H
F740-C	Amsphere? A3 Ligand Protein A Control	250 μl	F740
F968X	Avantor J.T.Baker® BAKERBOND® PROchievA? Protein A Antigen Concentrate	250 μl	F965
F743X	Amsphere? A3 Ligand Protein A Antigen Concentrate	300 μl	F740
F1068X	Protein L Antigen Concentrate	200 μl	F1065
F963X	EndonucleaseGTP® Antigen Concentrate	500 μl	F960
F031G	BSA Antigen Concentrate	1 ml	F030

雖然加標回收可以驗證HCP ELISA的準確性，但這只是整體方法學驗證的一部分。完整的驗證過程仍需包括精密度、LOD、LLOQ、ULOQ和HCP抗體覆蓋率等分析。Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點擊這里填寫信息索取，或直接聯系Cygnus中國總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過程中遇到任何問題，我們的技術支持團隊將竭誠為您提供解決方案和建議。

Cygnus Technologies專注為生物技術和生物制藥行業提供產品和分析方法超過25年，旨在加速研發階段和提高產品質量。Cygnus開發和生產的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測超過50種不同表達系統的特異性雜質。Cygnus作為專注于生物技術應用免疫檢測的高靈敏度分析技術的專家，其產品和服務已經被全球超過95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監管機構的廣泛認可。

北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內眾多知名藥企，CRO/CMO企業建立了長久穩定的合作關系。多年來西美杰的產品及服務幫助許多企業加速R&D階段，提高藥物質量、純度和安全，加速優化研發工藝，減少產品上市時間，降低QC成本。如您對上述產品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網站www.sqwzhs.com了解更多信息。